哺乳动物的性别决定是一场精妙的细胞命运选择：Y染色体上的Sry基因开启性腺体细胞向睾丸分化的程序，最终形成支持精子发生的生精小管与间质微环境。半个多世纪以来，科学家一直试图在体外重现这一过程，但始终无法绕过胚胎组织依赖的瓶颈。

2026年2月26日，日本大阪大学Katsuhiko Hayashi团队在《Science》发表题为“Reconstitution of sex determination and the testicular niche using mouse pluripotent stem cells”的研究论文，首次实现了完全利用小鼠多能干细胞（PSC）体外重建睾丸体细胞和完整功能性生态位——不仅重现了性别决定的完整分子程序，还组装出包含生精小管结构的睾丸类器官，最终支持生成了可育的功能性精子。这一突破不仅解开了性别决定的百年谜题，更打开了体外生殖细胞生产、不孕不育治疗的全新大门。

研     景

研究背景：体外生殖发育的核心难题

在哺乳动物胚胎发育中，生殖腺最初是“双潜能”状态，既可以分化为睾丸也可以分化为卵巢。性别决定的关键在于性腺中体细胞的分化方向：Y染色体携带的Sry基因上调Sox9表达，推动体细胞向睾丸支持细胞分化，后续逐步形成生精小管（精子发生的场所）和分泌睾酮的间质组织；若没有Sry基因，则会开启Foxl2通路，向卵巢方向分化。

此前，科学家虽能利用干细胞诱导出生殖细胞，但始终无法得到成熟的功能性精子，核心瓶颈就在于缺少功能性的睾丸体细胞微环境：要么依赖从胚胎中分离睾丸体细胞再重构，无法完全实现“从零构建”；要么诱导分化后无法形成有序的生精小管结构，难以支持生殖细胞的完整成熟过程。Hayashi团队的目标就是完全跳出胚胎组织依赖，仅用多能干细胞完成整个性别决定和睾丸重建。

实验过程：从细胞系改造到功能性验证，构建人工睾丸

第一步：构建报告基因细胞系，追踪性别分化命运

要在体外观察多能干细胞的性别分化方向，团队首先构建了双报告基因的小鼠多能干细胞系：在睾丸决定核心基因Sox9的位点插入绿色荧光蛋白（GFP）报告基因，Sox9激活后细胞会发出绿色荧光；同时在卵巢分化核心基因Foxl2的位点插入红色荧光蛋白（tdTomato）报告基因，Foxl2激活后细胞会发出红色荧光。通过荧光颜色，就能直观判断细胞的分化方向。

同时，团队同时制备了XY染色体（雄性基因型）和XX染色体（雌性基因型）两种干细胞系，用于后续对比性别分化过程。

第二步：探索分化条件，找到睾丸分化的“密钥”

团队将小鼠多能干细胞先诱导分化为中胚层细胞，再尝试不同的诱导条件组合，最终发现了关键的调控规律：

基础培养条件下，XY细胞会默认向卵巢方向分化：在常规氧浓度（5%低氧）、无信号通路调控的培养条件下，XY细胞也会大量激活Foxl2表达，呈现出雌性分化特征，颠覆了“XY细胞天然向睾丸分化”的认知；

BMP信号激活+WNT信号抑制+高氧环境，实现定向睾丸分化：团队通过组合不同信号通路调节剂和培养条件，最终找到最优方案：添加BMP4激活BMP通路，同时加入WNT通路抑制剂（LDN、IWR1、IWP2），并将培养环境的氧浓度提升到40%（高氧），就能让80%以上的XY干细胞定向激活Sox9，分化为睾丸体细胞谱系。

第三步：单细胞测序验证，重现体内性别决定程序

诱导分化第6天，团队对分化细胞进行单细胞RNA测序，解析细胞分化的全过程：

分化后的细胞中形成了一个特异性的细胞簇（c10簇），这个簇中特异性高表达睾丸决定的核心基因：Sry、Sox9、Amh，这三个基因正是胚胎发育中体内睾丸决定的标志性基因，证明体外诱导完美重现了体内性别决定的分子程序；

进一步分析细胞类型，诱导产物不仅包含了睾丸核心的支持细胞（Sertoli细胞，构成生精小管的结构基础），还分化出了间质细胞（Leydig细胞，负责分泌睾酮，维持精子发生），完美覆盖了睾丸发育所需的两类关键体细胞类型，成功重现了完整的细胞分化路径。

第四步：共培养组装睾丸类器官，形成有序生精结构

得到成熟的睾丸体细胞后，团队将多能干细胞预先诱导分化得到的原始生殖细胞样细胞（PGCLC） 共同加入培养体系，进行共培养组装：

诱导第3天开始，睾丸体细胞和原始生殖细胞逐渐聚集，自发形成三维类器官结构；

诱导第10天，类器官中已经形成了清晰有序的生精小管样结构，支持细胞排列在生精小管管壁，间质细胞分布在生精小管之间，完美复刻了体内睾丸的组织结构，而原始生殖细胞则分布在生精小管内部。

第五步：功能性验证，确认支持精子发生的能力

睾丸的核心功能是支持生殖细胞分化为成熟精子，团队开展了两步验证：

类器官内分化验证：共培养14天后，生精小管内的原始生殖细胞已经成功分化出了精原干细胞，部分细胞进一步进入减数分裂阶段，形成了初级精母细胞，证明重建的微环境可以启动精子发生的完整程序；

体内功能验证：将类器官中分化得到的精原干细胞分离出来，移植到不育小鼠的睾丸中，结果显示：这些精原干细胞能在小鼠睾丸中完成完整的精子发生过程，最终分化出了形态正常的功能性精子；用这些精子进行体外受精后移植到代孕母鼠体内，成功诞生了健康可育的后代，证明人工睾丸来源的精子完全具备生殖能力。

这项研究建立了完全由多能干细胞衍生的睾丸发育体外模型，为深入解析性腺发育、性别决定机制、生殖细胞与体细胞的相互作用提供了理想的研究工具。通过该模型，研究人员可以在体外精确调控各种因素，观察性腺体细胞和生殖细胞的发育过程，从而揭示性别决定和生殖发育的分子机制。

干细胞对睾丸体细胞的重建机制

01信号通路调控：精准开启雄性分化程序

哺乳动物的性别决定是一个复杂的过程，高度依赖于性腺体细胞的分化命运。在体内，具有双潜能的性腺通过一个严格调控的基因网络进行性别决定，这一过程由XY胚胎中Sry基因的表达启动，导致Sertoli细胞的分化和睾丸的形成。

Hayashi团队的研究发现，通过精确调控BMP和WNT信号通路，能够模拟体内的性别决定过程，诱导多能干细胞向睾丸体细胞分化。抑制BMP信号通路可以阻止细胞向雌性方向分化，而抑制WNT信号通路则能够促进Sry基因的表达，从而启动睾丸支持细胞的分化程序。这一发现揭示了性别决定过程中信号通路的关键作用，为体外重建睾丸微环境提供了重要的理论依据。

02细胞自组装：构建三维生精小管结构

TesLCs在培养皿中能够自行组装形成与体内生精小管高度相似的三维结构，这是实现生殖细胞分化的关键。研究表明，TesLCs之间通过细胞间的相互作用和信号传递，能够自发形成管状结构，并分泌细胞外基质成分，为生殖细胞的发育提供了适宜的物理和化学环境。

这种细胞自组装过程不仅重现了体内睾丸组织的结构特征，更重要的是模拟了体内生精小管中支持细胞与生殖细胞之间的相互作用。支持细胞为生殖细胞提供营养、激素支持和物理屏障，促进生殖细胞的增殖、分化和成熟。通过细胞自组装形成的三维结构，为生殖细胞的发育提供了一个接近体内的微环境，使得生殖细胞能够在体外完成从精原干细胞到成熟精子的整个发育过程。

03细胞间相互作用：维持生殖细胞的自我更新与分化

在睾丸类器官中，TesLCs与PGCLCs之间存在着密切的细胞间相互作用，这种相互作用对于维持生殖细胞的自我更新和分化至关重要。研究发现，TesLCs能够分泌多种细胞因子和生长因子，如干细胞因子（SCF）、胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）等，这些因子能够促进PGCLCs的增殖和自我更新，同时引导其向精原干细胞方向分化。

另一方面，PGCLCs也能够通过分泌信号分子反馈调节TesLCs的功能，维持睾丸微环境的稳定性。这种细胞间的相互作用形成了一个复杂的调控网络，确保了生殖细胞在体外环境中能够正常发育和成熟。

研究意义

这项研究是生殖生物学领域的里程碑式突破：它首次在完全不依赖胚胎组织的前提下，仅用多能干细胞从头重建了完整的功能性睾丸器官，不仅让科学家可以在体外直接观察性别决定的动态过程，更解决了体外精子发生的核心瓶颈。

未来，这项技术不仅可以用于研究性别发育异常的发病机制，还有望为男性不育患者提供全新的治疗方案——对于无法产生精子的不育患者，或许可以通过干细胞体外重建睾丸微环境，帮助患者生成自己的功能性精子；同时也为生殖毒理学、避孕药研发提供了完美的体外测试模型。这颗从培养皿中诞生的人工睾丸，正在重新定义人类对生殖发育的认知边界。

参考文献

1：Reconstitution of sex determination and the testicular niche using mouse pluripotent stem cells

免责声明：本文旨在科普相关知识，不作为医疗指导意见

编辑｜Zhang.ZG

审核｜Geng.ZG