在生命活动的精密调控网络中，细胞增殖是生物体生长、发育和修复的核心过程，而这一过程的稳定运行离不开各类“分子卫士”的保驾护航。核酸酶-解旋酶DNA2就是其中一员，它作为多功能基因组保护因子，从酵母到人类等多种生物的细胞增殖都依赖于它的正常功能。

英国萨塞克斯大学Ulrich Rass团队在Nature 在线发表题为“DNA2 enables growth by restricting recombination-restarted replication”的研究论文，该研究利用酵母和人类细胞证明，DNA2 抑制同源重组重启复制以及停滞的 DNA 复制叉处的检查点激活。在人类细胞中，当 DNA2 被降解时，这种控制机制的丧失会导致重组依赖性的 DNA 合成以及在细胞周期的 G2 期积累与 RPA 结合的单链 DNA。为我们揭开了DNA2调控细胞增殖、维护基因组稳定的全新机制，也为相关疾病的研究提供了重要的理论依据

cdc27-D1恢复了dna2-2细胞减少的细胞活力（扩展数据图3d).Dna2和Pfh1之间的相互作用也得到了类似的结果，Pfh1是有效D-环进展所需的解旋酶36。因此，编码核排除型38 pfh1的pfh1-mt抑制了RTS1的过度重组、检查点激活和dna2-2细胞的存活率低（扩展数据图3a至d）。

研究人员将迷你生长素诱导的degron（mAID）和小分子辅助关闭（SMASh）标签41的编码序列引入人上皮RPE-1细胞，以替换DNA2每个基因组拷贝的终止密码子（扩展数据图 4a).细胞还被修饰为多西环素诱导的水稻TIR1（OsTIR1）的表达，以通过mAID42实现受控的靶蛋白降解。通过添加多西环素与生长素吲哚-3-乙酸（IAA）和/或阿修那普利（Asv）的组合，可以激活SMASh标签介导的蛋白质降解，从而降解产生的双德隆标记的DNA2蛋白（DNA2dd）。在RPE-1 OsTIR1 DNA2dd细胞中加入强力霉素/IAA/Asv（DIA）药物混合物后，在4小时内不再检测到DNA2dd h（图 1a).

在克隆细胞存活试验中，向RPE-1 OsTIR1 DNA2dd细胞中添加DIA可消除集落形成（图1b） 并阻断细胞增殖（图。 1c).为了验证观察到的生长缺陷与DNA2的缺失有因果关系，用野生型DNA2互补DNA（cDNA）补充RPE-1 OsTIR1 DNA2dd细胞，在DNA2dd降解后恢复细胞增殖和集落形成（扩展数据图。 4b,c).

观察到具有降解DNA2dd的新生子细胞甚至没有经历一次随后的有丝分裂；这种对细胞分裂的恒定阻断可以通过添加ATRi来抑制，使细胞能够通过有丝分裂进行并形成活的子细胞（图。 1f和扩展数据图。 4d,e).

FBH1的耗竭，但SNF2易位酶的耗竭，显著减少了DIA处理的RPE-1 OsTIR1 DNA2dd细胞中的RPA灶（图。 3c,d).其中FBH1耗竭明显完全抑制了持续RPA-ssDNA积累的DNA2剥夺细胞亚群能够进行有丝分裂（图。 3d).HoRReR还取决于重组因子RAD51的链交换活性。发现RAD51标记了DNA2缺失细胞中的大多数RPA病灶（图。 3e). 短干扰RNA（siRNA）介导的Polδ亚基POLD3耗竭强烈抑制了DNA2剥夺细胞RPA病灶处的DNA合成（图。 3h).这些结果与同源重组依赖性DNA合成一致，该合成发生在迁移的D-环中，其中缠绕出来的新生ssDNA链在其尾部被RPA结合。

为了监测DIA处理后RPE-1 OsTIR1 DNA2dd细胞中的ATR活化，我们仔细检查了ATR激酶活性的靶标CHK1。CHK1磷酸化非常突出添加DIA后h，CHK1蛋白逐渐丢失（图。 4a） ，先前在G2细胞周期观察到的表型在外源DNA损伤后退出。

研究人员观察到G2中RPA病灶的形成首先与细胞周期蛋白B2从细胞质向细胞核的易位相关，然后与大多数RPA阳性细胞中细胞周期蛋白B124的丢失相关 添加DIA后h（图。 4d).只有一小部分细胞（18岁后约5%）显示S4和S8上RPA32的DNA双链断裂特异性磷酸化（pRPA），这总是与核或缺失的细胞周期蛋白B1相吻合（扩展数据图。 9e)

研究得出结论，需要依赖DNA2的叉加工来抑制停滞的复制中间体、HoRReR和细胞周期退出的积累，这为为什么DNA2对细胞增殖至关重要提供了新的解释（图。 4e).

报告表明，在培养的患者成纤维细胞中观察到与DNA2相关的小头畸形原始侏儒症、Seckel综合征和Rothmund-Thomson相关综合征中野生型DNA2的低浓度，以及衰老细胞。为了模拟DNA2浓度降低的影响，我们用强力霉素处理RPE-1 OsTIR1 DNA2dd细胞，并滴定IAA以逐渐诱导mAID降解标签（扩展数据图。 11a).在低IAA浓度下，细胞增殖基本不受影响，细胞核没有增大高IAA浓度阻碍了增殖，细胞显示细胞核增大，表明细胞周期退出，正如DNA2完全丧失所预期的那样。中等IAA浓度允许RPE-1 OsTIR1 DNA2dd细胞增殖，尽管增殖速率降低（图。 5a).在这些中等IAA浓度下，细胞分离成两个不同的群体，核大小正常或增大（图。 5b).因此，单个细胞退出细胞周期的倾向随着DNA2浓度的降低而增加。

研究表明，重组依赖性DNA合成的遗传扰动可以挽救Dna2突变细胞中过度的HoRReR、检查点激活和细胞周期阻滞。因此，Dna2功能障碍通过不受限制的HoRReR在远亲酵母物种中持续的G2/M检查点阻滞导致不可见。

实验性DNA2下调和Seckel综合征患者衍生的DNA2-T655A亚型的表达表明，存在一个临界水平的DNA2活性，在该水平下，细胞可以继续增殖而不会出现明显的DNA损伤，也可以进入HoRReR诱导的衰老。

01 DNA2是什么

DNA2是一种兼具核酸酶和解旋酶活性的多功能蛋白，长期以来，科学家们就知道它对细胞增殖至关重要，但在缺乏DNA2的情况下阻止细胞增殖的具体机制，以及DNA2相关疾病的分子病因却一直迷雾重重。此前的研究认为，DNA2在滞后链复制过程中对冈崎片段的加工发挥着关键作用，它能够切割由单链DNA结合蛋白RPA结合的5'块状结构，而这些结构难以被冈崎片段加工核酸酶FEN1作用。如果没有DNA2，这类块状结构可能会累积，进而激活DNA损伤检查点，这也解释了酵母中因失去DNA2而发生的致命G2/M检查点停滞现象。不过，关于DNA2缺陷酵母细胞中是否存在有毒的冈崎片段连接块状结构仍不明确，且人类DNA2在冈崎片段加工过程中的作用也缺乏直接证据。

02 DNA2限制重组重启复制的核心机制

Ulrich Rass团队的研究通过酵母和人类细胞实验，终于破解了这一难题，揭示了DNA2在细胞增殖和基因组稳定维护中的全新作用机制。

研究发现，DNA2能够抑制同源重组重启复制以及停滞的DNA复制叉处的检查点激活。在正常情况下，当DNA复制过程中遇到阻碍，复制叉停滞时，细胞会启动一些应急机制来试图重启复制，其中同源重组重启复制就是一种途径。但这种途径如果不受控制，可能会导致基因组的不稳定性，进而影响细胞的正常增殖。DNA2就像一个“调控开关”，严格限制着这种重组重启复制的发生，确保DNA复制过程的有序进行。

当人类细胞中的DNA2被降解时，这种调控机制就会丧失，细胞内会出现重组依赖性的DNA合成，并且在细胞周期的G2期积累大量与RPA结合的单链DNA。这些异常变化会触发DNA损伤检查点，最终导致在有丝分裂前由ATR-p21依赖性的细胞周期退出。这一过程解释了为何DNA2对细胞增殖至关重要。一旦DNA2功能缺失，细胞就无法正常完成细胞周期，增殖过程被阻断。

此外，研究还发现，DNA2的功能异常与细胞衰老密切相关。当表达来自Seckel综合征患者的DNA2低效突变体，或者DNA2部分降解时，细胞会随机进入衰老状态，增殖能力受到抑制。这一发现为解释与DNA2相关的原始矮小症疾病中的整体生长障碍提供了关键的概念框架，让我们对这类疾病的发病机制有了更深入的理解。

结     语

这项研究也为我们理解细胞衰老机制提供了新的视角。细胞衰老与多种疾病的发生发展密切相关，包括神经退行性疾病、心血管疾病等。通过深入研究DNA2与细胞衰老的关系，我们或许能够找到延缓细胞衰老、预防相关疾病的方法。

随着生物技术的不断发展，我们有理由相信，在不久的将来，我们将对DNA2的功能有更全面、深入的认识，并且能够利用这些知识为人类健康事业做出更大的贡献。DNA2这个神秘的“分子卫士”，将在生命科学的舞台上继续绽放光彩，为我们揭示更多生命的奥秘

参考文献

1：DNA2 enables growth by restricting recombination-restarted replication

免责声明：本文旨在科普相关知识，不作为医疗指导意见

编辑｜Zhang.ZG

审核｜Geng.ZG