外泌体作为细胞间信息传递的重要载体，在疾病诊断、治疗以及生物标志物研究等领域具有广泛的应用前景。而外泌体的分离纯化是研究外泌体功能与机制的前提条件，因此，快速高效地提取高质量的外泌体在其相关研究中具有重要作用。今天，小编为大家整理了热门的外泌体分离方法，一起来看看吧！

常用的外泌体分离方法

外泌体差速超速离心法（Ultracentrifugation）

一种广泛采用的外泌体分离黄金标准方法。基于不同蛋白质分子、囊泡、细胞及细胞碎片等在均匀悬液中沉降速度的差异，通过逐渐增加离心力或离心时间来实现外泌体的分离和提取。通过多个离心循环，离心力从低到高逐渐增加，以去除杂质并最终沉淀外泌体。

优点

操作简单：差速超速离心法操作简单，适合大体积样本中外泌体的分离和提取。 

高纯度：可以产生高纯度的外泌体，满足大多数实验和临床应用的需求。

缺点

耗时长：需要多个离心步骤，且时间较长（4-5小时），对实验人员的耐心和设备的稳定性要求较高。

成本高：依赖于昂贵的超速离心设备，增加了实验成本。

得率低：在多次离心过程中可能存在外泌体的损失，影响回收率。

密度梯度超速离心法（Density Gradient Ultracentrifugation）

结合了超速离心和密度梯度的原理，可以有效地将外泌体与其他大小、密度相近的颗粒（如蛋白质聚集体、凋亡小体等）分离开来。
 

优点

高效性：超速离心结合密度梯度可以高效地分离出高纯度的外泌体。

适用性广：适用于多种生物样本的外泌体分离。

可重复性高：实验结果具有较好的可重复性。

缺点

成本高：需要配备高速转子的超速离心机，设备成本较高。

操作复杂：操作步骤繁琐，需要较高的实验技能。

分离成本：密度梯度介质的成本较高，增加了实验的总成本。

超滤法（Ultrafiltration）

利用不同截留相对分子质量（MWCO）的超滤膜对样品进行选择性分离。在超滤过程中，溶剂及小分子物质被过滤到膜的另一侧，而相对大分子物质（如外泌体）则被截留在超滤膜上，以此达到分离外泌体的目的。

优点

操作方便：超滤法操作相对简单，不需要复杂的设备和技术。

富集效率高：通过选择合适的超滤膜孔径，可以有效地富集外泌体。

成本较低：超滤法所需的设备和耗材成本相对较低。

不影响外泌体生物活性：超滤过程中不需要使用变性剂等有害物质缺点。

缺点

过滤孔阻塞：长时间使用超滤膜可能会导致外泌体阻塞过滤孔，影响分离效率。

分离产量低：外泌体膜之间可能会发生互相黏附，导致分离产量降低。

需要选择合适的超滤膜孔径：不同样品和实验需求需要选择合适的超滤膜孔径以获得最佳分离效果。

免疫亲和层析法（Immunoaffinity Chromatography）

基于抗原-抗体特异性结合的原理，利用外泌体表面特定的生物标记物（如四跨膜蛋白超家族成员CD63、CD81、CD9等）作为配体，与相应的抗体结合。这些抗体被固定在固相载体（如磁珠、多孔二氧化硅单片板、膜亲和过滤器等）上，当含有外泌体的溶液通过时，外泌体表面的生物标记物会与抗体特异性结合，从而实现外泌体的分离纯化。

优点

高特异性：基于抗原-抗体特异性结合，能够准确分离出目标外泌体，减少非特异性污染。

保持生物活性：在温和的分离条件下进行，有助于保持外泌体的生物活性和功能完整性。

操作简便：相比其他分离方法，免疫亲和层析法操作步骤相对简单，易于实现自动化和规模化。

缺点

价格昂贵：取决于抗体的特异性，不适合大规模分离免疫亲和层析法的应用

空间排阻层析法（Size-Exclusion Chromatography）

也被称为尺寸排阻色谱法，是一种基于分子大小差异进行分离的技术。空间排阻色谱法利用填充有多孔聚合物微球的色谱柱，根据分子直径的大小进行分离。当待测样品通过色谱柱时，半径较小的分子需要更长的时间才能通过色谱柱的孔隙迁移，而大分子则从色谱柱中更早地洗脱出来。

优点

分离效率高：SEC能够精确分离大小相近的分子，因此在外泌体的提取中具有较高的分离效率。通过调整色谱柱的孔径和洗脱条件，可以实现对不同大小外泌体的有效分离。

保持生物活性：与超速离心等传统方法相比，SEC在分离过程中对外泌体的剪切力较小，有助于保持外泌体的生物活性和完整性。

高通量处理：SEC适用于高通量样品的处理，能够满足大规模外泌体提取的需求。

缺点

操作复杂：操作过程相对复杂，需要专业的仪器和技术支持。

耗时较长：不适合急需结果的场合。

限制较多：分离效果可能受到色谱柱材料、孔径大小和洗脱条件等因素的影响。

新兴的分离技术

免疫磁珠法
一种高效、特异的外泌体分离方法。该方法通过将具有磁性的磁珠表面包被特殊的抗体（如外泌体表面特异性抗体CD63、CD9等），利用抗原抗体特异性识别的特性来实现对外泌体的特异性吸附和分离。在外加磁场的作用下，与磁珠相连的外泌体被吸附并滞留在磁场中，从而实现与外泌体的分离。

优点

特异性高：通过特异性抗体与外泌体表面抗原的结合，可以高效地分离出目标外泌体。

操作简便：相比其他分离方法，免疫磁珠法操作更为简便快捷。

不影响外泌体形态完整：该方法在分离过程中对外泌体的形态和活性影响较小。

缺点

效率低：由于抗原抗体反应的限制，免疫磁珠法的分离效率相对较低。

易受环境因素影响：外泌体的生物活性易受pH和盐浓度等环境因素的影响，在分离过程中需要严格控制条件。

成本较高：特异性抗体的制备和磁珠的使用成本较高，增加了实验的成本。

微流体技术法（Microfluidics）

外泌体与微流体技术的结合是近年来外泌体研究领域的一个重要方向。微流体技术通过微管道系统处理或操纵微小流体，具有高通量、高特异性、低试剂消耗等优点，在外泌体的分离、表征和应用等方面展现出巨大潜力。微流控芯片技术通过设计复杂的微通道网络，结合物理、化学或生物方法，实现对生物颗粒的高效分离。在此外，微流体技术还可以与质谱、单细胞测序等高通量分析技术相结合，进一步揭示外泌体的组成和功能。

优点

高通量：微流体技术可以处理大量样本，提高实验效率。

高特异性：通过设计特定的微通道和捕获机制，可以实现对目标外泌体的高效分离和纯化。

低试剂消耗：相比传统方法，微流体技术可以显著降低试剂消耗量。

缺点

技术复杂度高：微流体技术的设计和操作相对复杂，需要较高的技术水平和设备投入。

成本高：目前微流体技术的设备和耗材成本较高，可能限制其在大规模应用中的普及。

优缺点一览图

免责声明：本文旨在科普相关知识，不作为医疗指导意见。

参考文献：

[1] Wiedmer, S K,Multia, E,Liangsupree, T, et al. Automated On-Line Isolation and Fractionation Method for Subpopulations of Extracellular Vesicles. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.), 2023, 2668, 99-108.

[2] 姜姗姗,尹羽琪,厉芊妤,等.哺乳动物外泌体：分离纯化、临床应用与展望[J/OL].中国生物工程杂志,1-17[2024-09-08].https://doi.org/10.13523/j.cb.2404028.

[3] Qian, X,Xie, F,Cui, D. Exploring Purification Methods of Exosomes from Different Biological Samples. BioMed research international, 2023, 2023, 2336536.

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